Ryzosfera fasoli jako naturalny degradator antybiotyków – przełomowe odkrycie

Czy ryzosfera fasoli to nowy sojusznik w walce z antybiotykami?

Ryzosfera fasoli jako rezerwuar aktynomycetów zdolnych do inaktywacji klarytromycyny – nowe odkrycie w walce z opornością na antybiotyki

Zanieczyszczenie środowiska antybiotykami staje się coraz poważniejszym problemem zdrowia publicznego. Naukowcy z powodzeniem zidentyfikowali naturalny rezerwuar bakterii zdolnych do rozkładania klarytromycyny – jednego z najczęściej przepisywanych antybiotyków makrolidowych. Badania opublikowane w Scientific Reports rzucają nowe światło na rolę mikroorganizmów glebowych w biodegradacji antybiotyków i ich potencjał w bioremediacji.

Ryzosfera – strefa gleby otaczającej korzenie roślin – odgrywa kluczową rolę w zdrowiu roślin i funkcjonowaniu ekosystemu glebowego. Jest to obszar intensywnej aktywności mikrobiologicznej, gdzie złożone interakcje między korzeniami a mikroorganizmami poprawiają kondycję roślin poprzez ułatwianie pobierania składników odżywczych, produkcję hormonów wzrostu i wytwarzanie związków przeciwdrobnoustrojowych. Co więcej, mikroorganizmy ryzosferowe mogą rozkładać szereg zanieczyszczeń antropogenicznych, w tym pozostałości farmaceutyków.

Antybiotyki makrolidowe, szczególnie klarytromycyna (CLR), należą do krytycznie ważnych antybiotyków w terapii ludzkiej i są jednymi z najczęściej przepisywanych antybiotyków w Europie Środkowej i Zachodniej. Ich pozostałości trafiają do środowiska głównie poprzez ścieki komunalne i przemysłowe, a następnie mogą przedostawać się do gleby przez stosowanie produktów z oczyszczalni ścieków (WWTP) w rolnictwie – czy to w formie biosolidów jako nawozów, czy poprzez nawadnianie oczyszczonymi ściekami.

“Koncentracje makrolidów w oczyszczonych ściekach często przekraczają wartości PNEC (Przewidywane Stężenie Niewywołujące Skutków), które zostały opracowane do oceny ryzyka zanieczyszczeń dla systemów biologicznych oraz ryzyka związanego z rozprzestrzenianiem się mechanizmów oporności na antybiotyki” – piszą autorzy badania.

Czy ryzosfera potrafi rozkładać klarytromycynę?

Badacze przeprowadzili dwuletni eksperyment w kontrolowanych warunkach, wykorzystując różne systemy zarządzania glebą: kontrolę (nawadnianie wodą z kranu – CMW), nawadnianie oczyszczonymi ściekami (CME), nawożenie biosolidami (CMB) oraz nawożenie kompostowanymi biosolidami (CMC). W uprawianej fasoli (Phaseolus vulgaris) badano mikrobiom ryzosfery oraz zdolność mikroorganizmów do degradacji klarytromycyny.

Wyniki analiz chemicznych potwierdziły obecność wszystkich trzech badanych makrolidów (erytromycyny, klarytromycyny i azytromycyny) w oczyszczonych ściekach, z najwyższymi stężeniami dla klarytromycyny (mediany 280 i 230 ng/L w latach 2021 i 2022). W biosolidach wykryto tylko azytromycynę i klarytromycynę, a w kompostowanych biosolidach jedynie azytromycynę. Co niepokojące, nawet w wodzie z kranu wykryto śladowe ilości klarytromycyny (5,9 ng/L i 1,5 ng/L w latach 2021 i 2022). Pomimo obecności makrolidów w produktach WWTP, nie osiągnęły one mierzalnych poziomów w glebie nawet po dwóch latach stosowania. Może to być spowodowane degradacją makrolidów przez mikroorganizmy glebowe, ale także ich wyciekiem z powodu obfitych opadów deszczu w sezonie letnim.

Czy nawadnianie oczyszczonymi ściekami i stosowanie biosolidów wpływa na mikrobiom ryzosfery? Okazuje się, że dodatki biosolidów (zarówno kompostowanych, jak i niekompostowanych) zmieniły zawartość składników odżywczych w porównaniu z kontrolą, zwiększając znacząco zawartość rozpuszczonego fosforu (DP) i węgla w biomasie mikrobiologicznej (C_mic). Samo nawadnianie oczyszczonymi ściekami nie miało wpływu na obserwowane parametry.

Zmiany te nie wpłynęły na różnorodność alfa bakterii w ryzosferze, jednak efekt zarządzania był widoczny w różnorodności beta. Obie modyfikacje biosolidami tworzyły odrębne skupiska, podczas gdy kontrola i nawadnianie oczyszczonymi ściekami wykazywały większe podobieństwo. Społeczności bakteryjne ryzosfery były zdominowane przez Proteobacteria (średnio 50,9%), a następnie Actinobacteriota (15,4%). Najliczniejsze rodziny to Commamonadaceae, Nitrosomonadaceae, Pseudomonadaceae, SC-I-84, Gemmatimonadaceae i Xanthobacteraceae.

Analiza różnicowa (DESeq2) wykazała różnice między społecznościami prokariontycznymi na poziomie rodziny w zależności od zarządzania glebą. Thermoactinomycetaceae zwiększyły swoją względną liczebność we wszystkich glebach z dodatkiem produktów WWTP (CME, CMC i CMB) w porównaniu z kontrolą, podczas gdy Oxalobacteraceae zwiększyły się tylko w CMB. Największa zmiana taksonomiczna dotyczyła Pseudomonadaceae, których względna liczebność wzrosła prawie dziewięciokrotnie w CMC i CMB w porównaniu z kontrolą.

Interesujące jest to, że nie zaobserwowano istotnych różnic między typami zarządzania w hodowlach bakterii z ryzosfery na podłożu nieselektywnym, jednak zaobserwowano zmiany na podłożu z dodatkiem klarytromycyny. Subpopulacja oporna na CLR była porównywalna w CMW, CME i CMC, ale była znacząco większa w CMB w porównaniu z CMW. Rozpowszechnienie bakterii opornych na CLR było trzykrotnie wyższe w CMB niż w pozostałych (4,2% vs 1,1-1,5%).

Czy mikrobiom ryzosfery wykazywał zdolność do degradacji klarytromycyny? Wbrew oczekiwaniom, analizy LC-MS wykazały, że populacja mikrobiologiczna ryzosfery nie degradowała CLR w danych warunkach eksperymentalnych. W pierwszym eksperymencie degradacyjnym (DG1) uwzględniono tylko typy zarządzania CMW i CME, zakładając wcześniejszą presję selekcyjną CLR obecną w oczyszczonych ściekach używanych do ciągłego długoterminowego nawadniania roślin. Oba typy zarządzania wykazały podobną odpowiedź na CLR jako jedyne źródło węgla – całkowita liczba komórek bakteryjnych nieznacznie spadła w 3. dniu i wzrosła w 11. dniu w porównaniu z kontrolą bez CLR.

Które mikroorganizmy odpowiadają za inaktywację antybiotyków?

Aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania kultury degradującej CLR, społeczności mikrobiologiczne ryzosfery wzbogacono rosnącymi stężeniami CLR w warunkach współmetabolicznych przez okres do czterech miesięcy. Wszystkie typy zarządzania zostały włączone do eksperymentu wzbogacania. Gdy ostateczne stężenie CLR osiągnęło 1 mg/L, sprawdzono żywotność wzbogaconych kultur poprzez standardową hodowlę na płytkach agarowych. Wartości CFU były podobne niezależnie od zarządzania. Mimo oczekiwań, że w danych warunkach eksperymentalnych nastąpi aktywacja mechanizmów degradacji, dane LC-MS nie wykazały aktywności degradacyjnej.

Aby scharakteryzować wzbogaconą populację mikrobiologiczną, przeprowadzono sekwencjonowanie amplikonów genu 16S rDNA z kultur uzyskanych przy końcowym stężeniu wzbogacenia (1 mg/L). Zarządzanie glebą nie miało wpływu na różnorodność alfa społeczności prokariontycznych. Jak oczekiwano, społeczności mikrobiologiczne wzbogaconych kultur różniły się znacząco od oryginalnej ryzosfery. Wzbogacenie CLR zmniejszyło różnorodność alfa i znacząco zmieniło strukturę społeczności mikrobiologicznych. Najbardziej licznym typem były Proteobacteria (91,4%) z niewielkim udziałem Bdellovibrionota (3,2%), Verrucomicrobiota (1,4%) i Armatimonadota (1%).

Jednak izolacja czystych kultur aktynomycetów z ryzosfery przyniosła przełomowe odkrycie. Z 111 izolatów o typowej morfologii aktynomycetów, które mogły rosnąć na podłożu z dodatkiem CLR, 32 wykazywało zdolność inaktywacji klarytromycyny. Najniższy odsetek zaobserwowano w CMW (7,7% z 13 izolatów), a porównywalny odsetek w innych typach zarządzania glebą: 30% (z 50), 27,7% (z 22) i 27% (z 26) odpowiednio dla CME, CMC i CMB.

Identyfikacja taksonomiczna sekwencji 16S rRNA ujawniła trzy rodzaje bakterii aktynomycetów inaktywujących CLR: Streptomyces (39 izolatów), Nocardiopsis (2 izolaty) i Nocardioides (1 izolat). Analiza filogenetyczna ujawniła sześć kladów Streptomyces sp., zdominowanych przez izolaty z grup S. albidoflavus, S. xiamenensis i S. anulatus.

Najsilniejszą aktywność inaktywującą wykazały izolaty zidentyfikowane jako S. xiamenensis (CME i CMC), grupa S. intermedius (CMB), grupa S. albidoflavus (wszystkie typy zarządzania glebą) i Nocardiopsis alba (CMB), podczas gdy izolaty z niejednoznaczną odpowiedzią zidentyfikowano jako grupa S. anulatus (CME, CMC i CMB), S. zaomyceticus (CME), grupa S. nigrescens (CME) i Nocardioides albus (CME).

Izolaty zostały dalej przetestowane przy użyciu testu modulacji antybiotyku w płynie (liquid-AMA). Łącznie 70% wykazało znaczny spadek stężenia CLR w zużytym medium. Wyniki obu testów modulacji antybiotyków przedstawiono na rysunku 3. 67% izolatów dało spójne wyniki w obu typach testów.

Podczas gdy niektóre klady Streptomyces inaktywujące CLR dawały identyczne wyniki niezależnie od typu zarządzania glebą (grupa S. albidoflavus), niektóre z licznie reprezentowanych kladów wykazywały odpowiedź specyficzną dla zarządzania. Izolaty z grupy S. anulatus inaktywowały CLR wydajniej, gdy były izolowane z ryzosfery nawadnianej oczyszczonymi ściekami. Ponadto izolaty S. xiamenensis odzyskiwano tylko z ryzosfery nawadnianej oczyszczonymi ściekami (CME, CMC).

Dokładność liquid-AMA została zweryfikowana poprzez pomiar resztkowego stężenia CLR w zużytym medium metodą LC-MS dla wybranych izolatów. Całkowite usunięcie (100%) CLR potwierdzono dla izolatów o silnej aktywności liquid-AMA (brak tworzenia strefy zahamowania). Wyniki fałszywie dodatnie wykluczono poprzez test sorpcji biomasy, który nie wykazał sorpcji CLR do biomasy mikrobiologicznej (testowano biomasę izolatów BCCO 10_2486, BCCO 10_2487, BCCO 10_2488 i BCCO 10_2496).

“Nasze wyniki pokazują, że ryzosfera fasoli uprawianej w glebie Haplic Cambisol służy jako naturalny rezerwuar aktynomycetów, które mogą inaktywować półsyntetyczny antybiotyk makrolidowy klarytromycynę” – podsumowują badacze. “Jednak zastosowanie produktów WWTP jako nawozu lub alternatywnego źródła wody do nawadniania prowadziło do znacznego wzrostu liczebności i różnorodności taksonomicznej aktynomycetów degradujących CLR.”

Jest to prawdopodobnie związane z pozostałościami makrolidów zawartymi w produktach WWTP i trwałą presją selekcyjną na mikrobiom ryzosfery. Wiedza na temat występowania streptomycetów w produktach WWTP jest ograniczona. Jednak uważa się, że streptomycety często kolonizują ludzi, a filotypy znalezione w tym badaniu były wcześniej związane z tkankami ludzkimi.

Jak odkrycia z ryzosfery wpływają na zdrowie pacjentów?

Dlaczego te odkrycia są istotne dla lekarzy? Biodegradacja antybiotyków jest starożytnym narzędziem, które zapewnia samoochronę bakteriom produkującym antybiotyki i służy jako naturalny mechanizm detoksykacji środowiska. Jednocześnie niektóre geny kodujące enzymy degradujące antybiotyki nadają również oporność na antybiotyki u bakterii chorobotwórczych. Ta podwójna rola genów degradujących antybiotyki musi być brana pod uwagę, a ocena ryzyka związanego z ich rozprzestrzenianiem się w środowisku wymaga dalszych badań.

Wcześniejsze badania wykazały, że pula genów oporności różni się między taksonami chorobotwórczymi a produkującymi antybiotyki oraz że istnieje bariera filogenetyczna dla ich przenoszenia. Przemawia to za wykorzystaniem gatunków Streptomyces degradujących antybiotyki (naturalnych mieszkańców gleby) w bioremediacji w celu zmniejszenia stężeń w środowisku, a tym samym spowolnienia rozwoju i rozprzestrzeniania się oporności na antybiotyki w zanieczyszczonych środowiskach.

Streptomycety są typowymi saprofitami glebowymi, często aktywnymi w ryzosferze różnych roślin. Preferują wzrost w bardziej ustrukturyzowanym środowisku dla złożonego rozwoju komórkowego i tworzenia zarodników oraz mają długi czas generacji. Dlatego w wzbogaconych kulturach zostały prawdopodobnie przerośnięte przez szybko rosnące bakterie. Chociaż były wcześniej izolowane z tkanek ludzkich, nie są uważane za patogeny obligatoryjne, z wyjątkiem tych powodujących endemiczną aktynomycetozę. Z drugiej strony, są one głównymi producentami naturalnych antybiotyków, w tym makrolidów. Dlatego mogą wytwarzać enzymy, które modyfikują i inaktywują antybiotyk w ramach samoobrony.

Czy resztkowe ilości antybiotyków w środowisku mogą mieć wpływ na zdrowie człowieka? To pytanie pozostaje otwarte i wymaga dalszych badań. Jednak wiedza o naturalnych mechanizmach degradacji antybiotyków przez mikroorganizmy glebowe może być kluczowa dla opracowania strategii ograniczania ekspozycji ludzi na te związki.

Badania te podkreślają znaczenie stosowania zarówno metod zależnych od hodowli, jak i niezależnych od hodowli w badaniach skupionych na degradacji antybiotyków. Ponadto, podczas gdy degradacja antybiotyków jest naturalną detoksykacją bakterii glebowych, jest ona również mechanizmem oporności na antybiotyki. Ta podwójna rola wymaga dalszych badań, aby w pełni zrozumieć jej wpływ i ocenić jej potencjał w bioremediacji.

W kontekście rosnącego problemu oporności na antybiotyki, odkrycie naturalnych mikroorganizmów zdolnych do degradacji klarytromycyny otwiera nowe możliwości w opracowywaniu strategii bioremediacji środowisk zanieczyszczonych antybiotykami. Może to przyczynić się do ograniczenia presji selekcyjnej na rozwój oporności bakterii i tym samym wspomóc zachowanie skuteczności antybiotyków w leczeniu infekcji u ludzi.

Podsumowanie

Naukowcy dokonali przełomowego odkrycia dotyczącego naturalnych mechanizmów degradacji antybiotyków w środowisku glebowym. Badania skupiły się na ryzosferze fasoli jako potencjalnym rezerwuarze mikroorganizmów zdolnych do rozkładania klarytromycyny – powszechnie stosowanego antybiotyku makrolidowego. W toku dwuletniego eksperymentu analizowano wpływ różnych systemów zarządzania glebą, w tym nawadniania oczyszczonymi ściekami oraz stosowania biosolidów, na mikrobiom ryzosfery. Kluczowym odkryciem było zidentyfikowanie 32 szczepów aktynomycetów, głównie z rodzaju Streptomyces, wykazujących zdolność do inaktywacji klarytromycyny. Szczególnie skuteczne okazały się szczepy S. xiamenensis, S. intermedius i S. albidoflavus. To odkrycie ma istotne znaczenie dla rozwoju strategii bioremediacji środowisk zanieczyszczonych antybiotykami oraz potencjalnego ograniczenia rozwoju antybiotykooporności.