Bicarinalin: peptyd z jadu mrówki skuteczniejszy od antybiotyków

Czy Bicarinalin to przełom w leczeniu Helicobacter pylori?

Bicarinalin – peptyd z jadu mrówek skutecznym narzędziem w walce z Helicobacter pylori

Helicobacter pylori to Gram-ujemna bakteria infekująca około połowę światowej populacji. Zakażenie tym patogenem prowadzi do stanów zapalnych przewodu pokarmowego, wrzodów trawiennych, raka żołądka, chłoniaka tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową (MALT) oraz innych zaburzeń. Pomimo stosowania różnorodnych terapii, całkowita eradykacja H. pylori pozostaje wyzwaniem, gdyż bakteria posiada mechanizmy oporności na kwas i czynniki kolonizacyjne umożliwiające jej przetrwanie w środowisku żołądka. Bakteria wytwarza wokół siebie osłonę z substancji neutralizujących kwas dzięki enzymowi ureazie.

W ostatnich latach globalna częstość występowania zakażeń H. pylori doprowadziła do powszechnego stosowania antybiotyków, co z kolei przyczyniło się do pojawienia się oporności wielolekowej. W praktyce klinicznej H. pylori jest zazwyczaj leczona kombinacją leków i inhibitorów pompy protonowej. Jednak szybkie rozprzestrzenianie się oporności na leki sprawia, że poszukiwanie alternatywnych strategii leczenia tego zakażenia staje się koniecznością. Czy peptydy antydrobnoustrojowe mogą być odpowiedzią na rosnący problem oporności?

Jak działają peptydy antydrobnoustrojowe i czym jest Bicarinalin?

Peptydy antydrobnoustrojowe (AMP) to stosunkowo krótkie, amfipatyczne cząsteczki zbudowane z około 10-100 aminokwasów, zwykle posiadające dodatni ładunek netto i często przyjmujące strukturę alfa-helikalną. AMP występują powszechnie u ludzi, zwierząt, roślin, stawonogów i mikroorganizmów, odgrywając kluczową rolę w odporności wrodzonej jako pierwsza linia obrony przed patogenami. Wykazują szerokie spektrum działania przeciwko bakteriom, grzybom i wirusom. Obecnie około 50 leków opartych na AMP znajduje się w fazie badań klinicznych, z czego 14 dotarło do fazy III, a tylko 11 wprowadzono na rynek. “Badania wykazują, że AMP mogą działać synergistycznie z konwencjonalnymi antybiotykami, oferując potencjał do zwalczania superbakterii, ograniczenia rozwoju oporności na leki i zwiększenia skuteczności antybiotyków” – podkreślają autorzy badania.

Jednym z obiecujących peptydów jest Bicarinalin – kationowy, amidowany na C-końcu, alfa-helikalny, liniowy peptyd wyizolowany z jadu mrówki Tetramorium bicarinatum myrmicine. Składa się z dwudziestu reszt aminokwasowych o sekwencji KIKIPWGKVKDFLVGGMKAV, a jego masa cząsteczkowa wynosi 2213,78 g/mol. Peptyd wykazuje szerokie spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego wobec różnorodnych bakterii, pasożytów i grzybów, przy minimalnym stężeniu hamującym od 0,45 μmol/L (Staphylococcus xylosus) do 97,5 μmol/L (Geotrichum candidum). Co istotne, w niskich stężeniach od 0,066 do 8,5 μmol/mL nie wykazuje działania hemolitycznego ani cytotoksycznego wobec ludzkich limfocytów.

Jakie mechanizmy aktywności kryją się za Bicarinalinem?

Bicarinalin jest stabilny wobec proteaz i może przetrwać w organizmie do 15 godzin. Jego pozytywny profil farmakokinetyczny potwierdza potencjał w chemioterapii przeciwdrobnoustrojowej. Ten nowatorski peptyd nie wykazuje podobieństwa sekwencji do wcześniej skatalogowanych cząsteczek w istniejących bazach danych. “Bicarinalin ma potencjał jako kandydat do opracowania nowego leku przeciwdrobnoustrojowego” – piszą autorzy badania. Przypuszcza się, że mechanizm działania przeciwbakteryjnego Bicarinalinu jest analogiczny do obserwowanego w innych AMP. Hamowanie wzrostu bakterii następuje poprzez permeabilizację błon bakteryjnych, prowadzącą do wycieku zawartości komórkowej do środowiska zewnętrznego. Oprócz wykazywania aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec wielu patogenów, jak donoszą badacze, zapobiega on również przyłączaniu się i osiedlaniu patogenów w tkankach.

Badanie miało na celu wykazanie potencjału Bicarinalinu jako środka do zwalczania H. pylori. Do tej pory nie przeprowadzono badań określających synergistyczne działanie Bicarinalinu ani wykazujących bezpośredni wpływ AMP na błonę, DNA i białko H. pylori. Dlatego kolejnym celem badania była ocena uszkodzeń strukturalnych wywołanych przez Bicarinalin w błonie bakteryjnej przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz określenie stopnia wycieku zawartości wewnątrzkomórkowej – DNA i białek – za pomocą uznanych testów kolorymetrycznych.

Czy wyniki in vitro potwierdzają skuteczność Bicarinalinu?

W badaniu metodą dyfuzji studzienkowej wykazano, że strefy zahamowania wzrostu H. pylori przez Bicarinalin zwiększały się znacząco wraz ze wzrostem stężenia. Przy stężeniu 32 μg/mL uzyskano strefę zahamowania o średnicy 18,3 mm dla szczepu ATCC. Przy niskich stężeniach (4-8 μg/mL) średnice stref były ograniczone do 7-8,7 mm. Przy średnim stężeniu 16 μg/mL średnica strefy wzrosła do około 9,7 mm. “Wyniki te wyraźnie pokazują, że Bicarinalin wykazuje zależne od dawki działanie hamujące na H. pylori” – podkreślają badacze.

Metodą mikrorozcieńczeń w bulionie określono minimalne stężenie hamujące (MIC). Lewofloksacyna (LEV) i amoksycylina (AMX) służyły jako kontrole pozytywne. Wartość MIC₉₉ – definiowana jako stężenie wymagane do zahamowania 99% wzrostu bakterii – została określona jako 4,8 μg/mL. Ocena statystyczna wartości gęstości optycznej (OD) wykazała zależne od dawki zwiększenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej Bicarinalinu. Co szczególnie interesujące, przy stężeniach 15 μg/mL i 30 μg/mL, Bicarinalin wykazywał silniejszą aktywność przeciwbakteryjną wobec H. pylori niż referencyjne antybiotyki LEV i AMX.

Czy Bicarinalin wzmacnia działanie antybiotyków i uszkadza komórki H. pylori?

W badaniu wykazano również potencjalne działanie synergistyczne Bicarinalinu z antybiotykami. Bakterie wykazywały najwyższą wrażliwość na kombinację Bicarinalinu i lewofloksacyny. Średnice stref zahamowania wzrostu wynosiły: 14,2 mm dla LEV, 8,9 mm dla TOB, 7,3 mm dla CLR, podczas gdy Bicarinalin miał średnicę strefy zahamowania 11 mm przy stężeniach 15 μg/mL i 30 μg/mL oraz 12 mm przy stężeniu 45 μg/mL. Natomiast średnica stref zahamowania dla Bicarinalinu w połączeniu z LEV wynosiła 20 mm, dla Bicarinalinu w połączeniu z CLR 16 mm i podobnie 16 mm, gdy Bicarinalin był łączony z TOB. Wyniki te wskazują, że Bicarinalin zwiększa skuteczność antybiotyków, gdy jest z nimi łączony, a nie stosowany samodzielnie, szczególnie w przypadku LEV, co sugeruje potencjał Bicarinalinu jako nowego środka przeciwko zakażeniom H. pylori.

Ocena wycieku DNA i białka dla szczepu ATCC H. pylori wykazała, że wyciek białka zwiększył się o 33,25%, a wycieki DNA o 55,10% po ekspozycji na Bicarinalin. Peptyd powodował większy wyciek komórkowego DNA i białka w porównaniu z kontrolą negatywną.

Analiza za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) potwierdziła cechy morfologiczne i uszkodzenia komórkowe wywołane przez Bicarinalin. Komórki H. pylori ATCC pobrane bezpośrednio z tkanki żołądka były nienaruszone, o spiralnym kształcie pręta. Po hodowli i inkubacji w MHB w laboratorium komórki przekształciły się w kształt kokoidalny. Po ekspozycji na Bicarinalin błona komórkowa została rozerwana, a komórki skurczyły się i zagregowały, z pęcherzykami na błonie zewnętrznej, co prowadziło do deformacji i zniszczenia błony komórkowej bakterii.

Badanie to wykazało, że Bicarinalin wykazuje znaczącą aktywność przeciwdrobnoustrojową wobec komercyjnego szczepu H. pylori ATCC. Wartość MIC₉₉ wymagana do osiągnięcia 99% zahamowania wzrostu bakterii odzwierciedla spójny potencjał przeciwbakteryjny. W szczególności przy wysokich stężeniach (15 μg/mL i 30 μg/mL) Bicarinalin wykazuje silniejszą aktywność przeciwdrobnoustrojową niż standardowe antybiotyki, takie jak lewofloksacyna i amoksycylina, demonstrując znaczący potencjał terapeutyczny w przypadkach klinicznych, gdzie oporność na antybiotyki jest powszechna.

Czy synergia z antybiotykami przynosi nowe możliwości terapeutyczne?

Czy Bicarinalin może być nowym narzędziem w walce z opornymi szczepami H. pylori? Wyniki badania sugerują, że tak. W badaniu Guzmana i współpracowników Bicarinalin był skuteczny wobec szczepu ATCC H. pylori i izolatów klinicznych z MIC₅₀ odpowiednio 8,6 μg·mL⁻¹ i 2,2 μg·mL⁻¹. Dodatkowo analiza mikroskopowa elektronowa wykazała, że związek znacząco zmniejsza potencjał H. pylori do przylegania do komórek żołądka przy stężeniu 0,25 μg·mL⁻¹, ale widoczny wpływ na błonę komórkową nie był obserwowany, dopóki stężenie nie zostało zwiększone do 10 μg·mL⁻¹. W naszym badaniu, Bicarinalin wykazał skuteczność przeciwko szczepowi ATCC H. pylori z MIC₉₉ wynoszącym 4,8 μg/mL, co sugeruje lepszą aktywność niż AMX, LEV, TET i CLR w zwalczaniu zakażenia H. pylori.

AMP i synergistyczne kombinacje antybiotyków stosowane w leczeniu są obiecującą strategią zwiększania skuteczności przeciwbakteryjnej, zmniejszania skutecznych dawek antybiotyków i zwalczania rozwoju oporności. Osiąga się to dzięki mechanizmom takim jak zwiększanie przepuszczalności błony przez AMP, niszczenie biofilmu i bezpośrednie wzmacnianie aktywności antybiotyków. Badanie wykazało, że peptydy antydrobnoustrojowe Magainin 2 i PGLa, które są skuteczne przeciwko bakteriom Gram-ujemnym i Gram-dodatnim oraz grzybom, gdy są stosowane pojedynczo, są bardziej skuteczne, gdy są stosowane w kombinacji. Jak donosi Naghmouchi i współpracownicy, peptyd przeciwdrobnoustrojowy nizyna Z, który sam nie wykazuje aktywności przeciwko bakteriom Gram-ujemnym, wykazał synergistyczne efekty przeciwko Pseudomonas fluorescens w połączeniu z ampicyliną. Podobnie w obecnym badaniu stwierdzono, że Bicarinalin jest skuteczny przeciwko szczepom H. pylori jako pojedynczy środek, a jego połączenie z LEV, CLR i TOB skutkowało wyraźnym synergistycznym wzmocnieniem aktywności przeciwbakteryjnej.

Jak Bicarinalin zakłóca integralność błony bakteryjnej?

Bakteryjna błona cytoplazmatyczna jest niezbędna do procesów takich jak transport składników odżywczych, osmoregulacja, oddychanie, ściana komórkowa i synteza lipidów. Utrzymanie jej integralności jest kluczowe, ponieważ jej zakłócenie może zaburzyć homeostazę komórkową, upośledzić metabolizm i prowadzić do śmierci komórki. AMP zazwyczaj wywierają swoje działanie bakteriobójcze poprzez celowanie i zakłócanie tej błony, powodując szybkie zmiany przepuszczalności i nieodwracalne uszkodzenia strukturalne, co ostatecznie prowadzi do lizy komórki.

W badaniu Narayana i współpracowników, skuteczność Epi-1 na morfologię H. pylori badano przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). Ekspozycja na Epi-1 prowadziła do całkowitej lizy błony, powodując uwolnienie zawartości komórkowej i ostatecznie śmierć komórki. Występowały pęcherzyki błonowe sugerujące tworzenie krzywizny błony typu siodłowego. Tene i współpracownicy przeprowadzili test przepuszczalności błony, aby ocenić wpływ Bicarinalinu na błony bakteryjne. Używając SYTOX Green, nieprzepuszczalnego przez błony fluorescencyjnego barwnika wiążącego DNA, ocenili wpływ Bicarinalinu na żywe komórki bakteryjne. Wzrost intensywności fluorescencji po dodaniu Bicarinalinu w różnych stężeniach do zawiesin Enterobacter lub Cronobacter wskazywał na zakłócenie błony. Podobnie, w naszym badaniu analiza SEM potwierdziła, że ekspozycja na Bicarinalin skutkowała kurczeniem się i agregacją komórek H. pylori, rozerwaniem błony, a na powierzchni błon zaobserwowano pęcherzyki. Podobnie w badaniu Ealesa i współpracowników, analiza SEM ujawniła, że występuje więcej zmian morfologicznych wraz ze wzrostem dawek czynników. Zmiany obejmują pęcherzyki, bardziej zróżnicowany kształt i kurczenie się komórek oraz uszkodzenie błony. Dodatkowo, pokrycie powierzchni również zmniejsza się. Wyniki te wskazują, że Bicarinalin wykorzystuje ten sam mechanizm działania na różne mikroorganizmy.

Metoda Bradforda do szacowania wycieku białka i stosowanie testu kolorymetrycznego do wykrywania DNA jest atrakcyjną metodą do pokazania potencjału związków do oddziaływania na patogeny na poziomie komórkowym. To podejście zostało zademonstrowane przez Hana i współpracowników, którzy wykryli wyciek komórkowego białka i DNA H. pylori poprzez test kolorymetryczny przy użyciu spektrofotometru. Nizyna została połączona z kwasem mlekowym, co skutkowało wyciekiem zawartości białka i DNA bakterii. Podobny efekt wykazała ampicylina. Jednak nie było znaczącego efektu, gdy nizyna i kwas mlekowy były stosowane samodzielnie. W przeciwieństwie do tego, dane w naszym badaniu wykazały, że sam Bicarinalin zwiększa wyciek DNA o 55,10% i białka o 33,25%, co demonstruje zdolność Bicarinalinu do uszkadzania błony H. pylori i przenikania przez błonę komórkową, co prowadzi do uszkodzenia struktury komórkowej i wycieku białka i DNA do środowiska zewnętrznego.

Jakie perspektywy kliniczne niesie Bicarinalin?

Najważniejszym wyzwaniem dla klinicznego wykorzystania AMP jest znaczne zmniejszenie ich skuteczności w środowiskach zasolonych i warunkach fizjologicznych, takich jak surowica. Valdivieso-Rivera i współpracownicy wykazali, że wartości MIC wzrastają trzykrotnie w tych warunkach. Mendes i współpracownicy wykazali, że modyfikacja lipidowa i skrócenie łańcucha peptydów zwiększało ich aktywność i zachowywało właściwości przeciwbakteryjne, przeciwbiofilmowe i membranolityczne w warunkach fizjologicznych zawierających surowicę i sól. “Przypuszcza się, że optymalizacja peptydów syntetycznych mogłaby obejść ograniczenia peptydów naturalnych i zapewnić silne środki przeciwdrobnoustrojowe o większym znaczeniu klinicznym” – konkludują autorzy.

Podsumowując, badanie to wykazuje, że Bicarinalin wykazuje działanie hamujące wobec H. pylori i ma potencjał do wzmacniania przeciwbakteryjnych efektów niektórych antybiotyków. Chociaż wyniki te są obiecujące, są niewystarczające do udowodnienia jednoznacznej interakcji synergistycznej. Zaleca się, aby przyszłe badania obejmowały walidację in vivo poprzez wdrożenie bardziej rygorystycznych metodologii, takich jak analiza kinetyki zabijania w czasie i indeksu frakcyjnego stężenia hamującego. Badania te przyczynią się do pełniejszego wyjaśnienia potencjału terapeutycznego, farmakokinetyki i profilu bezpieczeństwa Bicarinalinu w terapii skojarzonej.

Podsumowanie

Bicarinalin to obiecujący peptyd antydrobnoustrojowy wyizolowany z jadu mrówki Tetramorium bicarinatum, który może stanowić przełom w leczeniu zakażeń Helicobacter pylori. Bakteria ta infekuje około połowę światowej populacji i prowadzi do wrzodów trawiennych, raka żołądka oraz innych schorzeń, a jej eradykacja pozostaje wyzwaniem ze względu na rosnącą oporność wielolekową. Badania in vitro wykazały, że Bicarinalin działa bakteriobójczo w sposób zależny od dawki, osiągając minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii na poziomie 4,8 μg/mL. Co istotne, przy stężeniach 15 i 30 μg/mL peptyd wykazywał silniejszą aktywność przeciwbakteryjną niż standardowe antybiotyki, takie jak lewofloksacyna i amoksycylina. Mechanizm działania Bicarinalinu polega na permeabilizacji błon bakteryjnych, co prowadzi do wycieku zawartości komórkowej – badania potwierdziły wzrost wycieku DNA o ponad 55% i białka o ponad 33%. Analiza mikroskopowa ujawniła kurczenie się komórek bakteryjnych, rozerwanie błon i tworzenie pęcherzyków na ich powierzchni. Szczególnie obiecujące są wyniki dotyczące synergistycznego działania Bicarinalinu z konwencjonalnymi antybiotykami, zwłaszcza z lewofloksacyną, co może zwiększać skuteczność terapii i zmniejszać ryzyko rozwoju oporności. Peptyd wykazuje stabilność wobec proteaz i może przetrwać w organizmie do 15 godzin, przy minimalnej cytotoksyczności wobec ludzkich komórek. Chociaż wyniki badań in vitro są bardzo zachęcające, autorzy podkreślają konieczność przeprowadzenia walidacji in vivo oraz bardziej rygorystycznych badań klinicznych w celu pełnej oceny potencjału terapeutycznego, farmakokinetyki i profilu bezpieczeństwa Bicarinalinu jako nowego środka w walce z zakażeniami H. pylori.