Helicobacter pylori – ciche zagrożenie i rosnąca oporność na antybiotyki

Czy Helicobacter pylori stanowi ciche zagrożenie?

Infekcja Helicobacter pylori należy do najczęstszych przewlekłych zakażeń bakteryjnych u ludzi, dotykając około połowy światowej populacji. Ta gram-ujemna, mikroaerofilna, spiralna bakteria wyposażona w wici stanowi poważne wyzwanie terapeutyczne ze względu na rosnącą oporność na antybiotyki. Występowanie H. pylori różni się znacząco w zależności od regionu geograficznego, wieku, pochodzenia etnicznego oraz statusu socjoekonomicznego. W krajach rozwijających się wskaźniki zakażeń przekraczają nawet 80%, natomiast w Portugalii, która była przedmiotem badania, prewalencja wśród dzieci wynosi 31,6-66,25%, a wśród dorosłych 60-85%.

Choć większość zakażeń H. pylori przebiega bezobjawowo, bakteria ta predysponuje do rozwoju przewlekłego zapalenia żołądka, dyspepsji czynnościowej, wrzodów żołądka i dwunastnicy, a w skrajnych przypadkach także raka żołądka i chłoniaka typu MALT. “Zakażenie H. pylori należy do najczęstszych przewlekłych infekcji u ludzi, z wyraźnymi różnicami w częstości występowania zależnymi od regionu geograficznego” – podkreślają autorzy badania.

Czy tradycyjne terapie przestają działać?

Standardowe schematy leczenia zakażeń H. pylori obejmują inhibitor pompy protonowej (IPP) w połączeniu z przynajmniej dwoma antybiotykami, najczęściej klarytromycyną, metronidazolem, amoksycyliną, tetracykliną lub lewofloksacyną. Niepokojącym zjawiskiem jest jednak systematyczny spadek skuteczności terapii, głównie z powodu narastającej oporności bakterii na antybiotyki. W Portugalii, gdzie przeprowadzono opisywane badanie, metaanaliza dotycząca oporności H. pylori wykazała następujące wskaźniki: klarytromycyna – 42%, metronidazol – 25%, ciprofloksacyna – 9%, lewofloksacyna – 18%, podczas gdy oporność na tetracyklinę i amoksycylinę pozostaje na niskim poziomie (odpowiednio 0,2% i 0,1%).

H. pylori nabywa oporność na antybiotyki głównie poprzez mutacje chromosomalne, a nie przez horyzontalny transfer genów. W przypadku klarytromycyny, jednego z najczęściej stosowanych antybiotyków ze względu na stabilność w środowisku kwaśnym, oporność wynika z punktowych mutacji w regionie kodującym peptydylotransferazę 23S rRNA, głównie A2142C, A2142G i A2143G. Mutacje te zmniejszają powinowactwo klarytromycyny do rybosomów bakterii. Mechanizm oporności na fluorochinolony opiera się natomiast na mutacjach punktowych w genach gyrA i gyrB, kodujących gyrazę DNA, która jest celem tej grupy antybiotyków. Najczęstsze mutacje występują w aminokwasach 87 (N87K) i 91 (D91N, D91G, D91Y). Z kolei metronidazol, składnik terapii hybrydowych, równoczesnych, poczwórnych i sekwencyjnych, działa poprzez tworzenie cytotoksycznych rodników powodujących uszkodzenia DNA bakterii. Oporność na ten antybiotyk związana jest głównie z mutacjami w genach rdxA i frxA.

Jakie metody stosuje się przy wykrywaniu oporności?

Badacze z Portugalii postawili sobie za cel identyfikację mutacji genetycznych związanych z opornością na klarytromycynę, fluorochinolony i metronidazol bezpośrednio w próbkach biopsji żołądka oraz walidację tych wyników za pomocą modelowania in silico. Jest to szczególnie istotne w kontekście Portugalii, gdzie testy wrażliwości na antybiotyki dla H. pylori nie są wykonywane rutynowo, a znajomość regionalnych wzorców oporności ma kluczowe znaczenie dla skutecznej eradykacji.

Do badania włączono 33 pacjentów z objawami dyspeptycznymi, którzy zostali poddani endoskopii w prywatnej klinice gastroenterologicznej w Coimbrze. Od każdego pacjenta pobrano cztery biopsje żołądka (dwie z antrum i dwie z trzonu). Biopsje natychmiast przechowywano w ciekłym azocie, a następnie przenoszono do temperatury -80°C do dalszego wykorzystania. DNA wyizolowano z biopsji przy użyciu urządzenia MagNaLyser i zestawu MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I, zgodnie z instrukcjami producenta. Obecność H. pylori potwierdzono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, z wykorzystaniem specyficznych starterów do identyfikacji bakteryjnego genu flagellarnego. Spośród 33 pacjentów, u 22 (66,7%) potwierdzono zakażenie H. pylori.

Czy genetyczne mutacje kształtują oporność na antybiotyki?

Mutacje w genach warunkujących oporność na antybiotyki analizowano za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, a produkty PCR weryfikowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym, a następnie sekwencjonowanie. Uzyskane sekwencje analizowano przy użyciu narzędzia BLAST i porównywano ze szczepem referencyjnym H. pylori 26695. W badaniu zastosowano nowatorskie podejście łączące analizę molekularną z modelowaniem in silico, co pozwoliło na dogłębne zrozumienie mechanizmów oporności.

Oporność na klarytromycynę jest zazwyczaj związana z mutacjami punktowymi w regionie V domeny 23S rRNA, szczególnie w pozycjach A2142C, A2142G i A2143G. Interesująco, w analizowanych próbkach nie wykryto tych klasycznych mutacji, zidentyfikowano natomiast nowe warianty: A2006T, T2186C, T2206A, A2227G i T2241G. Analiza in silico wykazała jednak, że żadna z tych nowych mutacji nie znajduje się w pętli peptydylotransferazy, kluczowej dla działania klarytromycyny, co sugeruje, że mogą one nie przyczyniać się do oporności na ten antybiotyk.

Dla modelowania 23S rRNA, badacze wykorzystali pełną sekwencję genową podjednostki 23S rybosomalnego RNA z H. pylori 26695 dostępną w GenBank. Zastosowano narzędzie BLASTN do dopasowania amplifikowanej sekwencji PCR do 23S rRNA Escherichia coli. Do analizy interakcji między klarytromycyną a centrum peptydylotransferazy w 23S rRNA wykorzystano strukturę z bazy PDB o numerze 1J5A.

W przypadku oporności na fluorochinolony, badacze skupili się na analizie regionu determinującego oporność na chinolony (QRDR) w genie gyrA. “Mutacje w pozycjach 87 i 91 genu gyrA są najbardziej istotne dla rozwoju oporności na fluorochinolony, przy czym substytucje aminokwasowe w pozycji 87 wiążą się z wysokim poziomem oporności, podczas gdy zmiany w pozycji 91 mogą prowadzić do oporności na niższym poziomie” – wyjaśniają autorzy. W badaniu wykryto mutacje w tych kluczowych pozycjach u 27% próbek, co koreluje z ogólnym wskaźnikiem oporności na fluorochinolony w Portugalii. Ponadto zidentyfikowano mutacje o wysokiej częstości występowania w pozycjach 191 (M191I, 93%), 199 (V199A, 60%) i 208 (G208E, 87%), a także nowe, wcześniej nieopisane mutacje w pozycjach 145 (D145E), 200 (H200Y) i 219 (P219A).

Dla modelowania homologicznego podjednostki A gyrazy DNA, sekwencję aminokwasową GyrA z H. pylori (szczep 26695) uzyskano z bazy UniProt. Jako szablon wybrano strukturę 4Z2C dla gyrazy DNA z Streptococcus pneumoniae, która wykazuje 56% identyczności z sekwencją zapytania. Modelowanie homologiczne przeprowadzono przy użyciu programu Modeller wersja 9.19, a wizualizację i generowanie obrazów wykonano za pomocą UCSF Chimera 1.12.

Analiza wykazała, że szczególnie mutacje w pozycji 87, gdzie następuje zmiana asparaginy na treoninę, izoleucynę lub lizynę, mogą znacząco zmieniać środowisko miejsca wiązania antybiotyku, potencjalnie prowadząc do oporności. Czy te nowo odkryte mutacje mogą wpływać na skuteczność leczenia fluorochinolonami? Szczegółowa analiza typu mutacji i ich lokalizacji w strukturze białka sugeruje, że próbki 04, 06 i 20 z mutacjami w pozycji 87 oraz próbka 15 z mutacją w pozycji 91 mogą wykazywać oporność na fluorochinolony. Natomiast mutacja D145E w próbce 09, znajdująca się na końcu domeny CAP i polegająca na zamianie jednego aminokwasu kwasowego na inny, prawdopodobnie nie wpływa wystarczająco na strukturę lub środowisko, aby przyczynić się do oporności.

W odniesieniu do oporności na metronidazol, badacze przeanalizowali gen rdxA kodujący nitroreduktazę NADPH niewrażliwą na tlen, kluczowy enzym dla aktywacji metronidazolu. Zidentyfikowano liczne mutacje punktowe prowadzące do substytucji aminokwasów, m.in. w pozycjach 6 (Q6H), 16 (R16H), 30 (S30R), 56 (M56V), 59 (D59N), 90 (R90K), 97 (H97T), 98 (G98S), 106 (P106L), 108 (S108A), 118 (A118T), 123 (V123T), 131 (R131K), 172 (V172I) i 183 (A183V). Najczęściej występowała mutacja w pozycji 59 (86% próbek), następnie w pozycji 6 (71%) i 90 (57%).

Dla modelowania nitroreduktazy NADPH niewrażliwej na tlen (RdxA), sekwencję aminokwasową z H. pylori (szczep 26695) uzyskano z bazy UniProt. Jako szablon wybrano strukturę 3QDL, która ma 100% identyczności sekwencji z sekwencją zapytania. Ponieważ struktura 3QDL miała brakujące reszty w modelu od pozycji 97 do 128, wybrano istniejący model z repozytorium AlphaFold. Modelowanie mutacji przeprowadzono przy użyciu programu Modeller wersja 9.19, a wizualizację wykonano za pomocą UCSF Chimera 1.14.

Szczegółowa analiza in silico pozwoliła na ocenę wpływu tych mutacji na strukturę i funkcję enzymu RdxA. Czy wszystkie zidentyfikowane mutacje przyczyniają się do oporności na metronidazol? Badanie sugeruje, że mutacje R16H, M56V, P106L i A183V są znanymi czynnikami zmniejszającymi powinowactwo do oksydoreduktaz lub destabilizującymi tworzenie homodimerów, co bezpośrednio wpływa na funkcjonalność enzymu. W modelu R16H, histydyna ma krótszy łańcuch boczny niż arginina, co prowadzi do utraty możliwych interakcji wiązań wodorowych z FMN. W przypadku mutacji A183V, zmiana aminokwasów nie wydaje się wpływać na żadną widoczną interakcję z FMN, ale może być związana z większą sztywnością struktury β-kartki, co może wpływać na konformację miejsca wiązania.

W modelu M56V mutacja zachodzi na granicy obu łańcuchów. Zamiana aminokwasu zawierającego siarkę, jakim jest metionina, na krótszy, alifatyczny waliny, przewiduje utratę czterech kontaktów (pierwotnie dziewięciu), które stabilizują strukturę na granicy. Natomiast w modelu P106L zamiana proliny (alifatycznej, tworzącej pierścień z kręgosłupem) na leucynę (alifatyczną) pokazuje, że pozycja ta wydaje się stabilizować początek α-helisy, gdzie oryginalna prolina tworzy łącznie siedem kontaktów (z których dwa to wiązania wodorowe). Przy leucynie liczba ta wzrasta do dziewięciu kontaktów (zachowując dwa wiązania wodorowe).

Mutacje H97T, G98S, A118T, V123T i R131K mogą być mutacjami pomocniczymi, które przyczyniają się do oporności, ale same w sobie mogą nie być wystarczające do jej wywołania. Na przykład, w mutacji D59N (kwasowy asparaginian zastąpiony przez amidową asparaginę) wydaje się tworzyć bardziej oddalone interakcje, ułatwiając destabilizację “klapy”, w którą zaangażowana jest helisa, a w konsekwencji destabilizując pozycję FMN wewnątrz kieszeni wiążącej. W mutacji R90K, chemia i rozmiar aminokwasów są podobne, ale utrata dwóch grup aminowych wpływa na interakcje zaangażowane w stabilizację centralnej części struktury RdxA.

Czy nowe podejście może zoptymalizować leczenie?

Badanie to ma istotne implikacje kliniczne, szczególnie w regionach takich jak Portugalia, gdzie testy wrażliwości na antybiotyki nie są rutynowo wykonywane. “Wykrywanie mutacji w H. pylori warunkujących oporność na antybiotyki jest obecnie niezbędne dla skutecznych strategii leczenia, ponieważ występowanie oporności na antybiotyki u H. pylori różni się w zależności od kraju i jest uzależnione od ogólnego stopnia wykorzystania antybiotyków” – podsumowują autorzy.

Zaproponowane innowacyjne podejście łączące analizę genomiczną z modelowaniem in silico może stanowić wartościowe narzędzie do optymalizacji leczenia i rozwoju medycyny spersonalizowanej w zwalczaniu zakażeń H. pylori. Jakie są ograniczenia takiego podejścia? Autorzy przyznają, że badanie ma pewne ograniczenia, w tym małą liczebność próby, przeprowadzenie badania w jednym ośrodku medycznym oraz brak rutynowych testów wrażliwości na antybiotyki, które pozwoliłyby na ocenę fenotypowego wyrażenia zidentyfikowanych mutacji genetycznych.

Niemniej jednak, wyniki badania wskazują na wysokie poziomy mutacji warunkujących oporność na fluorochinolony i metronidazol w badanej populacji, podczas gdy nie zaobserwowano klasycznych mutacji związanych z opornością na klarytromycynę. Te odkrycia mogą pomóc w optymalizacji schematów leczenia zakażeń H. pylori w Portugalii i podobnych regionach o wysokiej prewalencji zakażeń i rosnącej oporności na antybiotyki.

Badanie to wprowadza innowacyjne podejście do wykrywania mutacji związanych z opornością H. pylori poprzez integrację analizy genomicznej z modelem in silico, który symuluje interakcje między antybiotykami a ich zmutowanymi celami. Wartość predykcyjna tych danych pozwala na optymalizację leczenia, umożliwiając doskonalenie medycyny spersonalizowanej w walce z tą powszechną infekcją bakteryjną.

Podsumowanie

Badanie przeprowadzone w Portugalii koncentruje się na analizie oporności Helicobacter pylori na antybiotyki poprzez identyfikację mutacji genetycznych i modelowanie in silico. H. pylori, bakteria infekująca około 50% światowej populacji, wykazuje rosnącą oporność na standardowe terapie antybiotykowe. W Portugalii prewalencja zakażeń wśród dorosłych wynosi 60-85%, a oporność na klarytromycynę sięga 42%. Badacze zidentyfikowali nowe mutacje genetyczne związane z opornością na klarytromycynę, fluorochinolony i metronidazol, wykorzystując nowatorskie połączenie analizy molekularnej z modelowaniem komputerowym. Szczególnie istotne okazały się mutacje w genach gyrA (oporność na fluorochinolony) oraz rdxA (oporność na metronidazol). Zaproponowana metodologia może znacząco przyczynić się do optymalizacji leczenia i rozwoju medycyny spersonalizowanej w zwalczaniu zakażeń H. pylori, mimo pewnych ograniczeń badania, takich jak mała liczebność próby i brak rutynowych testów wrażliwości na antybiotyki.

Bibliografia

Valada Pedro, Mata Ana, Brito Rui M. M., Gonçalves Teresa, Medeiros José A. and Nogueira Célia. Detection of Helicobacter pylori and the Genotypes of Resistance to Clarithromycin, Fluoroquinolones, and Metronidazole in Gastric Biopsies: An In Silico Analysis to Help Understand Antibiotic Resistance. Current Issues in Molecular Biology 2025, 47(3), 158-163. DOI: https://doi.org/10.3390/cimb47030187.