Mechanizmy oporności Helicobacter pylori na antybiotyki – wyzwania kliniczne

Czy Helicobacter pylori stanowi wyzwanie kliniczne?

Helicobacter pylori stanowi jeden z najczęstszych czynników infekcyjnych na świecie. Ta Gram-ujemna bakteria kolonizuje nabłonek żołądka, prowadząc do rozwoju szeregu schorzeń, w tym wrzodów trawiennych, chłoniaka tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową żołądka (MALT), raka żołądka oraz przewlekłego zapalenia błony śluzowej żołądka. Choć większość zakażonych pacjentów pozostaje bezobjawowa, a tylko niewielki odsetek rozwinie owrzodzenia lub nowotwór żołądka po długotrwałej infekcji, H. pylori nadal stanowi główną przyczynę wysokiej śmiertelności i zachorowalności na całym świecie.

Do najczęściej stosowanych antybiotyków w eradykacji H. pylori należą klarytromycyna, metronidazol, amoksycylina, lewofloksacylna i tetracyklina. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat wskaźnik oporności na antybiotyki systematycznie wzrasta, co stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Mechanizmy oporności na antybiotyki są zróżnicowane i obejmują zarówno zmiany w strukturach komórkowych bakterii, jak i mechanizmy enzymatyczne neutralizujące działanie leków.

Jakie mechanizmy oporności utrudniają leczenie H. pylori?

Klarytromycyna jest makrolidem hamującym syntezę białek bakteryjnych. H. pylori może rozwinąć oporność na ten lek w wyniku mutacji w genie 23S rRNA, który jest celem działania klarytromycyny. Mutacje punktowe w domenie V regionu 23S rRNA mogą zmieniać powinowactwo klarytromycyny do pętli peptydylotransferazy, prowadząc do oporności. Dodatkowo, zmiany w systemach transportowych mogą zmniejszać wewnątrzkomórkowe stężenie leku. Najczęstsze mutacje w genie 23S rRNA związane z opornością na klarytromycynę to A2143G, A2142G i A2142C. Na wrażliwość H. pylori na klarytromycynę wpływają również białka błony zewnętrznej. Białka takie jak HopT (BabB), HofC i OMP31 są nieobecne w szczepach wrażliwych na klarytromycynę, ale występują w szczepach opornych. Klarytromycyna jest jednym z kluczowych antybiotyków powszechnie stosowanych w schematach terapeutycznych zakażeń H. pylori. Oporność na makrolidy, takie jak klarytromycyna, obserwuje się z różną częstotliwością (od 1% do 10%) w różnych krajach, a oporność ta znacząco przyczynia się do niepowodzenia protokołów leczenia H. pylori.

Główną przyczyną oporności na metronidazol są mutacje w genie rdxA, kodującym nitroreduktazę niewrażliwą na tlen, oraz w genie frxA, kodującym reduktazę flawinową. Mutacje te zmniejszają zdolność metronidazolu do przekształcania się w aktywne formy (NO²⁻, NO₂²⁻), odpowiedzialne za uszkadzanie struktury DNA bakterii, co prowadzi do jego nieskuteczności.

Amoksycylina, jako antybiotyk beta-laktamowy, silnie wiąże się z białkami wiążącymi penicylinę (PBPs) i hamuje syntezę ściany komórkowej, prowadząc do lizy bakterii. Najczęstszym mechanizmem odpowiedzialnym za oporność na amoksycylinę jest obecność mutacji punktowych w genie pbp1A. Ponadto, mutacje w genach pbp2, pbp3, hefC, hopC i hofH również wiązane są z opornością H. pylori na amoksycylinę. Bakteria może rozwinąć oporność na amoksycylinę również poprzez produkcję beta-laktamaz, enzymów rozkładających strukturę leku, czyniąc go nieskutecznym. Zmiany w kanałach porynowych w błonie bakteryjnej mogą również zmniejszać wchłanianie amoksycyliny do komórki bakteryjnej.

Lewofloksacyna jest antybiotykiem z grupy fluorochinolonów, który wywiera działanie przeciwbakteryjne poprzez interakcję z gyrazą DNA, kodowaną przez geny gyrA i gyrB. Mutacje punktowe w regionach determinujących oporność na chinolony genu gyrA mogą utrudniać ten proces, prowadząc do oporności na fluorochinolony u H. pylori. Najczęstsze mutacje w szczepach opornych na lewofloksacynę występują w pozycjach 87, 88, 91 i 97 genu gyrA. Dodatkowo, mutacja w genie gyrB w pozycji 463 może również odgrywać rolę w oporności na fluorochinolony u H. pylori.

Tetracyklina, stosowana również w leczeniu zakażeń H. pylori, wykazuje mechanizmy oporności związane z aktywnym wypompowywaniem leku z komórki bakteryjnej. Bakterie mogą wytwarzać białka transportowe, które wypompowują tetracyklinę z komórki, zmniejszając jej skuteczność. Geny kodujące te transportery stanowią główny mechanizm oporności. Ponadto, oporność jest w dużej mierze związana z mutacjami punktowymi w genie tet-1 w obrębie 16S rRNA. Częstość występowania mutacji AGA (926-928) jest ściśle związana z poziomem oporności na tetracyklinę. Mutacje pojedynczych i podwójnych par zasad zazwyczaj powodują niski poziom oporności, podczas gdy mutacje potrójnych par zasad w regionie AGA (926-928) 16S rDNA są związane z wysokim poziomem oporności.

W wyniku długotrwałego leczenia antybiotykami H. pylori może rozwinąć jednoczesną oporność na wiele leków. Zjawisko to, znane jako oporność wielolekowa (MDR), utrudnia leczenie zakażeń H. pylori, ponieważ standardowe schematy leczenia mogą stać się nieskuteczne. Ze względu na rosnącą oporność H. pylori na antybiotyki, istnieje potrzeba ciągłego monitorowania skuteczności leczenia i opracowywania nowych strategii terapeutycznych. Terapie kombinowane, wraz z zastosowaniem nowych środków przeciwbakteryjnych, stanowią obecnie jedno z głównych podejść w zwalczaniu opornych szczepów H. pylori.

Jakie zmiany genetyczne potwierdzają oporność na klarytromycynę?

W świetle powyższych informacji, celem naszego badania była analiza częstości występowania i zmienności mutacji związanych z opornością H. pylori na klarytromycynę wśród pacjentów pediatrycznych w Polsce przy użyciu zestawu Bosphore^® Helicobacter pylori Genotyping Kit v1.

Większość badanych próbek stanowiły szczepy dzikie (WT); 30/45. Materiał genetyczny H. pylori nie został wykryty w dwóch próbkach (2/45). Mutacje punktowe wykryto łącznie w 12 próbkach, z czego jedna wykazywała podwójną mutację (zarówno A2142G, jak i A2143G), a jedna zawierała zarówno dziki typ H. pylori, jak i mutację A2142G.

Najczęstszą mutacją wśród badanych biopsji żołądka była A2143G (7/45). Mutację A2142G obserwowano prawie dwa razy rzadziej (3/45). Szczegółowe wyniki, w tym ocena histopatologiczna, zostały przedstawione w Materiałach Uzupełniających, Tabela S1.

W celu oceny związku między typem szczepu H. pylori (WT lub z mutacją) a zarówno stopniem nasilenia aktywności zapalnej, jak i stopniem gęstości kolonizacji, przeprowadzono analizę statystyczną. Dodatkowo analizowano związek między typem szczepu a wartością Ct uzyskaną podczas qPCR, ponieważ Ct jest odwrotnie proporcjonalne do ilości DNA obecnego w próbce. Nie zaobserwowano istotnego związku między obecnością/brakiem mutacji a stopniem zapalenia lub stopniem gęstości kolonizacji (p = 0,868; p = 0,818, odpowiednio). Jednakże analiza statystyczna wykazała, że szczepy dzikie (bez mutacji) miały wyższą wartość Ct (co wskazuje na mniejszą ilość DNA obecnego w próbce) w porównaniu do szczepów zmutowanych (p = 0,014).

Mutacje A2142G, A2142C i A2143G w genie 23S rRNA są głównymi mechanizmami genetycznymi oporności H. pylori na klarytromycynę, znacząco wpływającymi na skuteczność leczenia. Monitorowanie tych mutacji jest kluczowe dla optymalizacji terapii eradykacyjnych i ograniczania rozprzestrzeniania się oporności w populacjach bakteryjnych. Klarytromycyna, antybiotyk makrolidowy, działa poprzez wiązanie się z bakteryjną podjednostką rybosomalną 50S, hamując tym samym translację i blokując syntezę białek. Wymienione powyżej mutacje zmieniają strukturę miejsca wiązania klarytromycyny w podjednostce rybosomalnej 50S. W rezultacie klarytromycyna nie może skutecznie się wiązać, co prowadzi do utraty jej aktywności bakteriostatycznej.

Rozkład mutacji oporności na klarytromycynę wykazuje regionalne różnice. W Japonii i Chinach mutacje A2143G odpowiadają za ponad 90% i 100% przypadków oporności na klarytromycynę, choć wyniki te opierają się na stosunkowo małej liczbie pacjentów. Ponadto, większość przypadków oporności na klarytromycynę w Korei Południowej została potwierdzona jako związana z mutacją A2143G.

Jakie wyzwania stawia diagnostyka i leczenie H. pylori?

W Stanach Zjednoczonych częstość występowania mutacji A2142G i A2143G waha się odpowiednio od 48% do 53% i od 39% do 45%, podczas gdy mutacja A2142C jest obserwowana w 0% do 7% przypadków. Podobnie w Europie, mutacja A2142G występuje w 23% do 33% DNA szczepów H. pylori, A2143G pojawia się w 44% do 67%, a mutacja A2142C jest raportowana w 2% do 10% przypadków.

W naszym badaniu zbadano częstość występowania mutacji A2142C, A2142G i A2143G w H. pylori i wykryto je w próbkach biopsji tkanek od pacjentów pediatrycznych hospitalizowanych w Bydgoszczy w Polsce. Nasze badanie wykazało, że najczęściej wykrywaną mutacją była A2143G (58,3%). Mutacja ta występowała prawie dwa razy częściej niż A2142G (33,3%). Mutacji A2142C nie wykryto w żadnym przypadku. Obserwacje te są zgodne z innymi doniesieniami. Badania wskazują, że mutacja A2143G jest najbardziej rozpowszechniona w szczepach H. pylori opornych na klarytromycynę, podczas gdy mutacja A2142G jest mniej powszechna. Ponadto, mutacja A2142C jest najrzadziej obserwowana wśród mutacji związanych z opornością H. pylori na klarytromycynę. Na przykład, jedno z badań wykazało, że mutacja A2143G została wykryta w 69,8% przypadków, podczas gdy mutacja A2142G była obecna w mniejszym odsetku (11,7%). Z kolei w badaniu brazylijskim mutację A2143G wykryto w 82,7% opornych szczepów, podczas gdy A2142G pojawiła się w 11,5% przypadków.

Warto zauważyć, że mutacja A2142G była związana z wyższymi wartościami minimalnego stężenia hamującego (MIC), wskazującymi na silniejszą oporność. Podobnie, polskie badanie ujawniło, że mutacja A2143G była obecna w 72% szczepów opornych na klarytromycynę, podczas gdy A2142G zidentyfikowano tylko w 9%. Inne badanie skupiające się na pacjentach pediatrycznych, zarówno objawowych, jak i bezobjawowych, z zakażeniem H. pylori również wykazało, że mutacja A2143G była najczęściej wykrywaną. Mutacje A2143G zaobserwowano u 10,9% dzieci, a A2142G u 6,9%. Mutacja A2143G była najczęstsza w grupie wiekowej 5-18 lat (39,1%).

Dość interesujące są wyniki badania przeprowadzonego przez badaczy z Sudanu. Używając PCR specyficznego dla alleli, badacze wykazali, że mutacja punktowa A2142G była obecna w 9 z 53 (~17%) próbek, podczas gdy mutacja A2143G nie została wykryta w żadnej próbce przy użyciu tej metody. Odmienne wyniki uzyskano poprzez sekwencjonowanie DNA, które wykryło mutację A2142G w jednej próbce i mutację A2143G w pięciu próbkach. Powyższe badanie wykazało wyższą częstość (36%) wykrywania mutacji przy użyciu sekwencjonowania DNA w porównaniu do PCR specyficznego dla alleli (17%). Te różnice wskazują na niższą czułość PCR specyficznego dla alleli w porównaniu do sekwencjonowania DNA, podkreślając znaczenie opracowywania i standaryzacji nowych metod diagnostycznych w tym celu. Na poparcie tej tezy można przytoczyć badanie przeprowadzone przez Ghaith i wsp. Badacze nie wykryli mutacji punktowej A2143G w żadnej z badanych próbek przy użyciu PCR, mimo próbowania różnych protokołów PCR. Jednakże, zarówno mutacje A2142G, jak i A2143G zostały zidentyfikowane przy użyciu sekwencjonowania DNA. Badacze doszli do wniosku, że istnieje tylko jedna różnica nukleotydowa między dzikim typem DNA a mutacją punktową w sekwencji DNA. Dlatego nietypowe mutacje, które są obecne w dużym nadmiarze alleli typu dzikiego, są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych testów zmienności genów. Wzorce żywieniowe, trendy w stosowaniu antybiotyków i polityka opieki zdrowotnej odgrywają znaczącą rolę w rozwoju oporności na antybiotyki w danym społeczeństwie. Badania wskazują na dodatnią korelację między spożyciem makrolidów i chinolonów w społeczności a odpowiednią opornością H. pylori w krajach europejskich. Ponadto, kompleksowa meta-analiza przeprowadzona przez Kuo i wsp. ujawniła, że znaczący wzrost oporności na klarytromycynę z 7% przed 2000 r. do 21% w latach 2011-2015 w regionie Azji i Pacyfiku mógł być przypisany zwiększonemu spożyciu makrolidów. Oporność na metronidazol miała tendencję do bycia wyższą w krajach rozwijających się, takich jak Nepal, Bangladesz, Pakistan, Bhutan, Wietnam i Indie, podczas gdy wydawała się być niższa w krajach o wyższych wskaźnikach rozwoju społeczno-ekonomicznego, takich jak Japonia. Częste stosowanie tego taniego antybiotyku w zakażeniach pasożytniczych, zapaleniu miednicy mniejszej i zakażeniach stomatologicznych w krajach rozwijających się przyczyniło się do tych różnic. Zaobserwowano również znaczny wzrost oporności na lewofloksacynę, zwiększający się z 2% przed 2000 r. do 27% w latach 2011-2015. Badania Megraud i wsp. oraz Liou i wsp. wykazały, że oporność na fluorochinolony korelowała ze spożyciem fluorochinolonów odpowiednio w Europie i na Tajwanie. Dodatkowo, czynniki żywieniowe, takie jak wysokie spożycie fermentowanych pokarmów lub probiotycznych jogurtów, które wpływają na skład mikrobioty żołądkowej, mogą również odgrywać rolę w modulowaniu adaptacji lub przeżycia bakterii i być związane z rozwojem oporności lub zwiększonym/zmniejszonym ryzykiem zakażenia.

Jak przeprowadzono badania genotypowe H. pylori?

Interesującym przypadkiem jest podwójna mutacja, którą w naszym badaniu znaleziono tylko w jednej próbce. Jednoczesne występowanie mutacji A2142G i A2143G w tym samym szczepie lub podwójne zakażenie jest niezwykle rzadkie. Podobne wyniki raportowali badacze z Korei. Noh i wsp., w swojej analizie 70 próbek, zidentyfikowali podwójną mutację tylko w jednej próbce. Co warte uwagi, minimalne stężenie hamujące klarytromycyny w tej próbce było najwyższe ze wszystkich i przekraczało 128 mg/L, wskazując na wysoki poziom oporności w podwójnym mutancie. Inne badania również potwierdzają rzadkość podwójnych mutacji. Na przykład, w badaniu obejmującym 91 próbek, tylko jedna próbka wśród opornych na klarytromycynę zawierała szczep z podwójną mutacją, co stanowiło 6,2%. Z kolei w szeroko zakrojonym badaniu obejmującym 431 pacjentów, w tym 91 z potwierdzoną klinicznie istotną mutacją oporności na klarytromycynę, tylko trzy próbki zawierały podwójną mutację A2143G i A2142G.

Inną interesującą obserwacją jest wykrycie zarówno szczepu dzikiego, jak i zmutowanego w próbce od tego samego pacjenta, co odnotowano w naszym badaniu w jednym przypadku. Nie badaliśmy szczegółowo mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska. Jednakże należy rozważyć dwie główne możliwości – reinfekcję innym szczepem lub współkolonizację przez szczepy dzikie i zmutowane. Reinfekcja odnosi się do nabycia nowego szczepu H. pylori, potencjalnie o różnych wzorcach oporności, po leczeniu lub ustąpieniu pierwotnego zakażenia. Współkolonizacja występuje, gdy wiele szczepów istnieje jednocześnie w tym samym gospodarzu. W przypadku H. pylori, może to prowadzić do złożonych interakcji między szczepami dzikimi i opornymi, potencjalnie wpływając na wyniki leczenia i rozwój oporności. Wcześniejsze badania wykazały, że współkolonizacja różnymi szczepami H. pylori może mieć ważne implikacje dla utrzymywania się zakażenia i powodzenia terapii eradykacyjnej i powinna być brana pod uwagę przy interpretacji wyników testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Sugerowano, że współkolonizacja mogłaby prowadzić do konkurencyjnych interakcji między szczepami, potencjalnie wpływając na ogólny profil oporności populacji bakteryjnej w organizmie gospodarza. Taka dynamika może przyczyniać się do niepowodzenia standardowych schematów leczenia i wymuszać bardziej spersonalizowane podejście do terapii. Rozróżnienie między reinfekcją a współkolonizacją może być wyzwaniem, szczególnie bez szczegółowej analizy molekularnej. Techniki takie jak typowanie szczepów i sekwencjonowanie nowej generacji lub fingerprinty RAPD mogłyby pomóc wyjaśnić te mechanizmy i dostarczyć bardziej precyzyjnych informacji na temat roli różnorodności szczepów w rozwoju oporności. Rozważymy ich wykorzystanie w przyszłych badaniach, aby uzyskać pełny obraz mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za oporność. Istnieją ograniczone dane o mieszaninie szczepów zmutowanych i dzikich opublikowane w literaturze. Jest to bardzo rzadkie zjawisko, udokumentowane tylko sporadycznie. Badanie przeprowadzone przez Krashias i wsp. wykazało, że wśród 41 badanych próbek, tylko jedna zawierała mieszaninę szczepów z mutacją punktową A2142G i niezmutowanych. Na szczególną uwagę zasługują badania przeprowadzone przez wietnamsko-włoski zespół badawczy, ponieważ mieszaninę szczepów dzikich i mutantów znaleziono w 50% próbek zawierających A2142G, co jest bardzo wysokim odsetkiem. Wysoki wskaźnik i częstość występowania mieszaniny mutantów i szczepów dzikich może być zależna od wieku, ponieważ badacze wykazali korelację między wiekiem a obecnością mutacji A2143G. Średni wiek pacjentów z czystą mutacją A2143G był znacznie wyższy niż średni wiek pacjentów z mieszaniną szczepów mutantów A2143G i dzikich H. pylori. Może to być częściowo wyjaśnione długą historią stosowania antybiotyków w starszej grupie, co skutkowało wyjątkowo wysokim wskaźnikiem mutacji. Podobne wyniki raportowano w badaniach przeprowadzonych we Francji (25% dla A2142G; 18,6% dla A2143G) i w Portugalii (32,3% ogółem). Średni wiek pacjentów tylko z mutacją A2143G był znacznie wyższy w porównaniu do tych z mieszaniną mutantów A2143G i szczepów dzikich H. pylori. Potrzebne są dodatkowe badania nad mieszaniną szczepów dzikich i zmutowanych, szczególnie dotyczące ich implikacji klinicznych w leczeniu H. pylori.

W naszym badaniu dwie próbki były negatywne dla DNA H. pylori pomimo pozytywnych wyników histopatologicznych i gastroskopowych, podczas gdy jedna próbka dała wynik “nieważny”. Te rozbieżności podkreślają potencjalne wyzwania diagnostyki molekularnej. Jednym z możliwych powodów niemożności wykrycia DNA H. pylori jest niski ładunek bakteryjny w próbce, co może wpływać na czułość testu genotypowania. Ponadto, obecność inhibitorów PCR, takich jak śluz, składniki krwi lub inne substancje, może zakłócać proces amplifikacji, prowadząc do wyników fałszywie negatywnych. Innym czynnikiem do rozważenia są nieodłączne różnice metodologiczne między technikami diagnostycznymi: podczas gdy histopatologia i gastroskopia identyfikują H. pylori na poziomie tkankowym, testy molekularne opierają się na obecności bakteryjnego DNA, które nie zawsze może być odpowiednio wyekstrahowane lub wykryte. Nie możemy wykluczyć, że wymienione czynniki spowodowały błąd podczas izolacji DNA materiału genetycznego.

Wynik “nieważny” zaobserwowany w jednej próbce, mimo powtórnego testowania, budzi obawy dotyczące potencjalnych problemów technicznych; jednakże, podobne czynniki jak w przypadku wyniku negatywnego mogą również przyczyniać się do tego wyniku, takie jak niewystarczająca ilość materiału genetycznego lub obecność substancji hamujących PCR. Takie incydenty podkreślają znaczenie właściwego pobierania, obchodzenia się i przetwarzania próbek w celu zminimalizowania potencjalnych błędów. Wyniki te podkreślają potrzebę kompleksowego podejścia diagnostycznego do wykrywania H. pylori, szczególnie u pacjentów pediatrycznych. Podczas gdy testy molekularne dostarczają cennych informacji o mutacjach oporności, wykrywanie powinno opierać się na różnych testach w celu weryfikacji uzyskanych wyników. Wydaje się, że połączenie metod genotypowych z tradycyjnymi technikami histopatologicznymi i endoskopowymi może zwiększyć dokładność diagnostyczną i poprawić zarządzanie pacjentem. W przypadkach, gdy testy molekularne dają niejednoznaczne lub negatywne wyniki pomimo klinicznego podejrzenia, należy rozważyć powtórzenie testu na innej próbce lub użycie alternatywnej dostępnej metody diagnostycznej.

Co ciekawe, analiza statystyczna wykazała, że wartości Ct uzyskane dla próbek z obecnością zmutowanych szczepów H. pylori były niższe, co jest równoważne z wyższą ilością DNA H. pylori w próbce w porównaniu do szczepów dzikich. Ta różnica w wartościach Ct może być wyjaśniona kilkoma czynnikami. Szczepy zmutowane mogą wykazywać zwiększoną zdolność kolonizacji lub zwiększoną oporność na leczenie, co mogłoby prowadzić do wyższego ładunku bakteryjnego w próbce. Oporność na niektóre antybiotyki umożliwia im kolonizację i namnażanie się w środowisku żołądka i potencjalnie zwiększa ich obfitość w próbce, przyczyniając się tym samym do wyższego ogólnego stężenia DNA H. pylori. Ponadto, zmiany genetyczne w H. pylori mogłyby wpływać na jego patogenność, prowadząc do bardziej intensywnego zakażenia. Ta zwiększona patogenność mogłaby skutkować wyższym ładunkiem bakteryjnym w próbce, co byłoby odzwierciedlone przez niższą wartość Ct. Dlatego obserwowana różnica w wartościach Ct między szczepami WT a zmutowanymi może dostarczyć cennych informacji na temat podstawowej dynamiki zakażenia i ładunku bakteryjnego związanego z różnymi genotypami H. pylori. Brak statystycznie istotnych związków między typem szczepu H. pylori (WT lub zmutowany) a zarówno stopniem zapalenia, jak i stopniem gęstości kolonizacji sugeruje, że obecność mutacji związanych z opornością na antybiotyki nie wpływa znacząco na wynik histopatologiczny. Wskazuje to, że czynniki takie jak odpowiedź immunologiczna gospodarza, mechanizmy wirulencji bakteryjnej niezwiązane z opornością na antybiotyki, czas trwania zakażenia i czynniki środowiskowe mają większy wpływ na zmiany błony śluzowej żołądka.

Jak rosnąca oporność H. pylori wpływa na praktykę lekarską?

Istotną kliniczną obawą związaną z rosnącą częstością występowania oporności H. pylori na klarytromycynę jest potencjalne niepowodzenie leczenia. Wraz ze wzrostem wskaźników oporności, standardowa terapia może nie być już skuteczna, prowadząc do utrzymujących się zakażeń i powikłań, takich jak wrzody trawienne i rak żołądka. W takich przypadkach, dostosowane podejścia terapeutyczne, w tym stosowanie alternatywnych antybiotyków lub terapii kombinowanych, są niezbędne do poprawy wyników leczenia. W analizie metagenomicznej, Ma i wsp. wykazali, że w leczeniu pierwszego rzutu, terapia dostosowana okazała się bardziej skuteczna niż terapia empiryczna. W terapii drugiego rzutu nie zaobserwowano znaczących różnic między tymi dwoma podejściami. Podobny wynik znaleziono w leczeniach obejmujących kombinację terapii drugiego i trzeciego rzutu. Jeśli chodzi o zdarzenia niepożądane, nie odnotowano większych różnic między tymi dwiema opcjami leczenia. W analizie podgrup różnych podejść empirycznych, terapia dostosowana wykazała najbardziej znaczącą korzyść w porównaniu do konwencjonalnej terapii potrójnej. Z kolei, w badaniu przeprowadzonym przez Kim i wsp. wykazano, że terapia dostosowana oparta na oporności genotypowej była znacznie bardziej skuteczna niż terapia empiryczna w eradykacji H. pylori. Wskaźniki eradykacji wynosiły 65,7% (201/306) w grupie terapii empirycznej i 81,9% (235/287) w grupie terapii dostosowanej. Nie było różnicy w przestrzeganiu zaleceń między tymi dwiema grupami. W meta-analizie przeprowadzonej przez Rokkas i wsp., badacze wykazali, że chociaż terapia dostosowana okazała się bardziej skuteczna niż leczenie empiryczne, wskaźnik eradykacji >90% osiągnięto tylko w 15 (44%) badań, a >95% tylko w 6 (17,6%). Na podstawie tego, badacze doszli do wniosku, że podczas gdy terapia dostosowana była lepsza od leczenia empirycznego, brak optymalizacji terapii uniemożliwił osiągnięcie wysokich wskaźników wyleczenia (>90%). Wyniki te podkreślają, że zakażenie H. pylori, podobnie jak inne choroby zakaźne, powinno podążać za zasadami zarządzania antybiotykami zgodnie z wytycznymi leczenia.

Jak przeprowadzono badania genotypowe H. pylori?

W badaniu wykorzystano próbki biopsji żołądkowej uzyskane od pacjentów pediatrycznych w wieku od 2 do 17 lat (n = 45), które zostały klinicznie zidentyfikowane jako pozytywne na podstawie badania gastroskopowego/histopatologicznego (zgodnie z klasyfikacją Sydney) i/lub pozytywnego wyniku w teście ureazowym. Pacjenci ci byli oceniani w Zakładzie Endoskopii Pediatrycznej i Badań Czynnościowych Przewodu Pokarmowego Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu, Polska. Kryteria włączenia do badania były następujące: początkowa diagnoza przewlekłych lub nawracających niefunkcjonalnych objawów dyspeptycznych oraz pisemna zgoda rodziców (dla dzieci <16 lat) lub zarówno rodziców, jak i pacjenta na górną endoskopię przewodu pokarmowego. Protokół badawczy otrzymał zatwierdzenie od Komisji Bioetycznej Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Kod zatwierdzenia komisji etycznej: KB 772/2018, 20 listopada 2018.

Próbki biopsji przeznaczone do izolacji DNA zostały początkowo poddane mechanicznej homogenizacji przez około jedną minutę przy użyciu ręcznych homogenizatorów (Squisher-Single, ZymoResearch, Irvine, CA, USA) kompatybilnych z 1,5 ml probówkami typu Eppendorf. Po dokładnym rozgnieceniu i homogenizacji, próbki poddano trawieniu w 37°C przez 30 minut w 200 µL roztworu trypsyny (5 mg/ml, roztwór Trypsyny EDTA, Sigma, Darmstadt, Niemcy) w celu zwiększenia skuteczności ekstrakcji DNA. Następnie DNA izolowano przy użyciu zestawu GeneProof Pathogen Free DNA Isolation Kit (GeneProof, Brno, Czechy), zgodnie z protokołem producenta dla próbek klinicznych. Wyekstrahowane próbki DNA były następnie przechowywane w temperaturze -20°C do dalszej analizy.

DNA wyizolowane ze szczepu referencyjnego (DSM 21031 Helicobacter pylori) służyło jako kontrola pozytywna dla całej oceny.

Zestaw Bosphore^® Helicobacter pylori Genotyping Kit v1 wykorzystuje multiplex PCR, zawierający kontrolę wewnętrzną do monitorowania potencjalnego hamowania PCR. W jednej reakcji, zarówno DNA H. pylori, jak i kontrola wewnętrzna są jednocześnie amplifikowane przy użyciu specyficznych dla sekwencji starterów. Sygnały fluorescencyjne z amplifikacji szablonów dzikiego typu i zmutowanych H. pylori są wykrywane za pomocą sond znakowanych FAM i Cy5 na końcu 3′, przy użyciu odpowiednich kanałów detekcji. Tymczasem amplifikacja kontroli wewnętrznej generuje sygnał fluorescencyjny wykrywany przez osobną sondę znakowaną na końcu 5′ HEX, który jest obserwowany przez odpowiedni kanał.

Były trzy oddzielne mieszaniny reakcyjne, każda zawierająca 12,5 μL mieszaniny PCR; 3 μL mieszaniny detekcyjnej nr 1, 2 lub 3; 0,5 μL kontroli wewnętrznej; i 9 μL badanego DNA. Mieszanina detekcyjna 1 zawierała startery forward i reverse, wraz z podwójnie znakowanymi sondami, zaprojektowanymi do specyficznego celowania w mutację oporności H. pylori na klarytromycynę A2142G, wariant dziki i kontrolę wewnętrzną. Mieszanina detekcyjna 2 zawierała startery forward i reverse, a także podwójnie znakowane sondy, które specyficznie wykrywają mutację oporności H. pylori na klarytromycynę A2143G, podwójną mutację (A2142G i A2143G) oraz kontrolę wewnętrzną. Mieszanina detekcyjna 3 zawierała startery forward i reverse, wraz z podwójnie znakowanymi sondami, które są specyficzne dla mutacji oporności H. pylori na klarytromycynę A2142C, podwójnej mutacji (A2142C i A2143G) oraz kontroli wewnętrznej.

DNA wyekstrahowane z referencyjnego szczepu H. pylori (DSM 21031) i woda o czystości do biologii molekularnej (EURx, Polska) służyły odpowiednio jako kontrole pozytywne i negatywne dla badania.

Do przeprowadzenia reakcji amplifikacji wykorzystano analizator cobas z480 (Roche, Bazylea, Szwajcaria).

Interpretacja wyników została przeprowadzona zgodnie z zaleceniami producenta. Analiza statystyczna została wykonana przy użyciu IBM SPSS Statistics wersja 28. Wartość p < 0,05 uznano za statystycznie istotną. Porównania między grupami dla zmiennych ilościowych przeprowadzono przy użyciu testu t dla prób niezależnych. Związki między zmiennymi kategorycznymi i porządkowymi oceniano za pomocą testu chi-kwadrat z poprawką Fishera.

Jak rosnąca oporność H. pylori wpływa na praktykę lekarską?

Rosnąca oporność H. pylori na klarytromycynę pozostaje znaczącym wyzwaniem w skutecznym leczeniu zakażeń, szczególnie u pacjentów pediatrycznych. Nasze badanie potwierdza, że mutacja A2143G jest najbardziej rozpowszechnioną zmianą genetyczną związaną z opornością, następnie A2142G, podczas gdy A2142C nie została wykryta. Obecność mieszanych zakażeń, w tym zarówno szczepów dzikich, jak i zmutowanych u tego samego pacjenta, sugeruje złożoną dynamikę adaptacji bakteryjnej i rozwoju oporności. Dodatkowo, rzadkie występowanie podwójnych mutacji podkreśla potencjał dla wysoce opornych szczepów, które mogłyby znacząco wpłynąć na terapię eradykacyjną. Wyniki te podkreślają potrzebę ciągłego nadzoru molekularnego i zindywidualizowanych strategii leczenia w celu poprawy wyników pacjentów. Przyszłe badania powinny eksplorować alternatywne opcje terapeutyczne, takie jak nowe antybiotyki lub terapie kombinowane, aby sprostać rosnącemu wyzwaniu oporności na antybiotyki w zakażeniach H. pylori.

Podsumowanie

Helicobacter pylori jest jednym z najczęstszych czynników infekcyjnych na świecie, a rosnąca oporność na antybiotyki stanowi poważne wyzwanie w leczeniu zakażeń. Badania wykazały, że najczęstszą mutacją związaną z opornością na klarytromycynę jest A2143G, występująca w 58,3% przypadków, podczas gdy mutacja A2142G występuje w 33,3% przypadków. Mutacji A2142C nie wykryto w żadnej z badanych próbek. Zaobserwowano także rzadkie przypadki podwójnych mutacji oraz współwystępowania szczepów dzikich i zmutowanych. Analiza statystyczna wykazała, że szczepy zmutowane charakteryzują się niższymi wartościami Ct, co wskazuje na wyższą ilość DNA bakteryjnego w próbce. Nie stwierdzono istotnego związku między typem szczepu a stopniem zapalenia lub gęstością kolonizacji. Wyniki badań podkreślają potrzebę indywidualnego podejścia do leczenia, opartego na monitorowaniu oporności i dostosowywaniu terapii do profilu genetycznego bakterii.