Nanocząsteczki albuminy jako nośniki klarytromycyny w terapii

Czy nanocząsteczki mogą zrewolucjonizować dostarczanie antybiotyków?

Nanocząsteczki albuminy bydlęcej obciążone klarytromycyną (CLA-BSA NPs) stanowią obiecujący system dostarczania leku o zwiększonej skuteczności terapeutycznej. Makrolidy, w tym klarytromycyna, należą do najbezpieczniejszych antybiotyków o szerokim spektrum działania, które wiążą się z podjednostką 50S rybosomu bakteryjnego, hamując syntezę białek niezbędnych do wzrostu i replikacji bakterii. Wykazują skuteczność wobec licznych bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, takich jak Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum i Mycoplasma pneumoniae, co świadczy o ich szerokim zastosowaniu klinicznym.

Właściwości fizykochemiczne makrolidów, takie jak hydrofobowość, wpływają na ich farmakokinetykę i farmakodynamikę. Pozwalają one na efektywną penetrację tkanek i akumulację komórkową, co potwierdza ich duża objętość dystrybucji. Jednak mimo zalet długiego okresu półtrwania i swobodnego przemieszczania się leku między tkankami, zmniejszenie depozycji leku w miejscu infekcji może prowadzić do niepowodzenia terapii i rozwoju oporności bakteryjnej. Ponadto słaba hydrofilowość i niestabilność w środowisku kwaśnym ograniczają wchłanianie makrolidów do krwiobiegu, co tłumaczy ich niską biodostępność. Te ograniczenia stworzyły potrzebę opracowania nowych metod efektywnego dostarczania antybiotyków do miejsca działania.

Jakie korzyści przynosi enkapsulacja klarytromycyny?

Klarytromycyna (CLA) jest makrolidem drugiej generacji o szerokim spektrum działania, pochodną erytromycyny. Charakteryzuje się niższymi minimalnymi stężeniami hamującymi (MIC) i wyższą stabilnością w środowisku kwaśnym, co poprawia jej biodostępność. CLA jest stosowana głównie w leczeniu infekcji układu oddechowego, skóry i tkanek miękkich. Co istotne, liczne badania wykazały, że CLA, związek o niskiej toksyczności i niskim koszcie, posiada również działanie antyproliferacyjne przeciwko różnym nowotworom. Wśród proponowanych mechanizmów działania przeciwnowotworowego CLA wymienia się bezpośredni efekt antyproliferacyjny, hamowanie autofagii, zmniejszenie produkcji cytokin prozapalnych oraz działanie antyangiogenne.

Badacze z powodzeniem zsyntetyzowali nanocząsteczki CLA-BSA przy użyciu metody desolvacji i scharakteryzowali je za pomocą różnych technik, w tym dynamicznego rozpraszania światła (DLS), dyfrakcji rentgenowskiej (XRD), spektroskopii FTIR, analizy termograwimetrycznej (TGA) i mikroskopii elektronowej (TEM). Wyniki potwierdziły jednolity rozmiar cząstek (130-140 nm), wysoką wydajność enkapsulacji (65,9%) oraz zwiększone uwalnianie leku (50,9%) w redukcyjnym buforze octanowym zawierającym glutation (GSH). Ta ostatnia cecha jest szczególnie istotna, ponieważ albumina może być uważana za bioredukowalny polimer, który może podlegać wymianie tiol-disiarczkowej w warunkach redukcyjnych, co sprzyja kontrolowanemu uwalnianiu leku w specyficznych mikrośrodowiskach.

Co mówi analiza TEM o strukturze nanocząsteczek?

Analiza TEM wykazała, że nanocząsteczki BSA mają gładką, w przybliżeniu sferyczną formę z pustym rdzeniem. Natomiast CLA-BSA NPs są nieco większe, z subtelnymi zmianami tekstury powierzchni, co wskazuje na skuteczne enkapsulowanie leku. Różnice w gęstości elektronowej, morfologii, niewielka agregacja i obecność cząstek z ciemnym rdzeniem dodatkowo potwierdzają inkorporację CLA w nanocząsteczkach. Te odkrycia podkreślają potencjał nanocząsteczek BSA jako efektywnych nośników leków, zwiększających rozpuszczalność i biodostępność CLA.

Jak CLA-BSA NPs radzą sobie w walce z bakteriami?

Badania in vitro wykazały, że CLA-BSA NPs posiadają lepszą aktywność przeciwbakteryjną, szczególnie wobec Bacillus cereus, z minimalnym stężeniem hamującym (MIC) wynoszącym 0,032 µg/mL, w porównaniu do 0,053 µg/mL dla wolnej klarytromycyny. Test dyfuzji dyskowej wykazał nieco wyższą wrażliwość szczepów Bacillus cereus na CLA-BSA NPs niż szczepów Staphylococcus aureus, ze średnimi strefami zahamowania wynoszącymi odpowiednio 22,7 ± 0,25 mm i 19,7 ± 0,057 mm. Ta aktywność była porównywalna z leczeniem wolną CLA, z strefami zahamowania 27,7 ± 0,058 mm i 23,5 ± 0,11 mm odpowiednio dla Bacillus cereus i Staphylococcus aureus. Puste nanocząsteczki BSA nie wykazywały aktywności przeciwbakteryjnej.

Wyniki nie wykazały znaczącej poprawy działania przeciwbakteryjnego CLA-BSA NPs w porównaniu do wolnej CLA, co można wyjaśnić kilkoma zjawiskami. Po pierwsze, receptory albuminy są nieobecne na powierzchniach bakteryjnych. Uzasadnienie tego badania wynika głównie z odkrycia, że nanocząsteczki na bazie albuminy są skutecznymi nośnikami antybiotyków skierowanych przeciwko bakteriom wewnątrzkomórkowym. Stan zapalny, który występuje z powodu inwazji bakteryjnej, stymuluje nadekspresję receptorów albuminy na powierzchniach zainfekowanych tkanek, co skutkuje lepszym wychwytem komórkowym i akumulacją przez zainfekowane komórki, ale nie przez bakterie. Po drugie, uwalnianie leku z systemów na bazie albuminy jest mediowane przez enzymy, więc oczekuje się, że osiągnie szybkie usunięcie patogenu w zapalonych tkankach, ponieważ oferują one wysoką aktywność enzymatyczną, co skutkuje szybkim uwalnianiem i depozycją leku.

Czy CLA-BSA NPs mogą być sprzymierzeńcem terapii nowotworowej?

Co istotne, CLA-BSA NPs wykazały również obiecujące działanie przeciwnowotworowe wobec komórek raka płuc A549, z wartościami IC₅₀ wynoszącymi 47,5 ± 9,6 μM dla CLA-BSA NPs i 66,1 ± 11,3 μM dla wolnej CLA. Jednocześnie zaobserwowano minimalny wpływ na normalne ludzkie fibroblasty skóry (HDFs), co wskazuje na selektywność wobec komórek nowotworowych. Badania wykazały, że klarytromycyna nie wpływa na aktywność proliferacyjną komórek, ale zmniejsza inwazyjność komórek A549 w sposób zależny od dawki poprzez hamowanie ekspresji specyficznych mediatorów zapalnych, takich jak fosforylaza tymidynowa (TP) oraz integryny α₂ i β₂.

Z drugiej strony, wyniki wykazały nieistotną aktywność przeciwnowotworową wobec linii komórkowych MDA-231 i MCF-7, z wartościami IC₅₀ > 100 µM. Badanie przeprowadzone przez Amani i wsp. wykazało, że ponad 90% żywotności komórek MCF-7 obserwowano po 48 godzinach inkubacji z klarytromycyną w stężeniach od 5 do 100 µM, co pokrywa się z naszym odkryciem, że monoterapia klarytromycyną nie wykazuje aktywności przeciwnowotworowej wobec komórek MCF-7. Podobne wyniki uzyskano dla komórek MDA-MB-231 przez Komatsu i wsp., którzy stwierdzili, że monoterapia klarytromycyną nie może samodzielnie zwalczać potrójnie ujemnego raka piersi. Jednak zwiększa cytotoksyczność środków przeciwnowotworowych, gdy jest podawana w połączeniu.

Jak albumina wpływa na właściwości nanocząstek?

Zastosowanie albuminy bydlęcej jako nośnika oferuje liczne korzyści. BSA składa się z 583 aminokwasów, ma masę cząsteczkową 66,4 kDa i punkt izoelektryczny 4,7. W ramach odpowiedzi zapalnej i uszkodzenia tkanek odnotowano nadekspresję receptorów albuminy, szczególnie GP60. Wykorzystanie mechanizmów regulacji w górę poprzez opracowanie nanocząstek BSA obciążonych lekiem ułatwia specyficzną akumulację w tkankach i oferuje przedłużone uwalnianie leku w obrębie tkanek docelowych, co w konsekwencji zwiększa skuteczność terapeutyczną.

Interesującym aspektem badań było również zaobserwowanie, że wraz ze wzrostem stężenia BSA wielkość cząstek zmniejszała się przy stałym stosunku wody do etanolu, co jest sprzeczne z wynikami przedstawionymi w poprzednich badaniach. Kilka badań wykazało, że nanocząsteczki BSA wykazują zależne od stężenia tworzenie agregatów. W związku z tym, wraz ze wzrostem stężenia BSA, więcej cząsteczek białka jest dostępnych do tworzenia nanocząstek, a mniejsza odległość między cząsteczkami albuminy umożliwia interakcje białko-białko. Prowadzi to do szybszego samodzielnego tworzenia nanocząstek i większej liczby miejsc nukleacji, co skutkuje większą liczbą mniejszych cząstek albuminy o wąskim rozkładzie wielkości cząstek.

Jak wypada profil uwalniania i stabilności nanocząsteczek?

Wyniki badań in vitro uwalniania leku wykazały, że CLA-BSA NPs wykazują zwiększone uwalnianie CLA w warunkach redukcyjnych w porównaniu do warunków nieredukcyjnych. Co istotne, nie zaobserwowano początkowego gwałtownego uwalniania, co wskazuje na jednolite enkapsulowanie. W przypadku PBS i buforu octanu sodu, gdzie media są wolne od czynników redukujących (GSH), CLA-BSA NPs wykazały skumulowane uwalnianie 6,36% i 8,69% po 8 godzinach. Po 72 godzinach skumulowane uwalnianie osiągnęło 5,61% w PBS i 39,32% w buforze octanu sodu. Stabilność nanocząstek wyjaśnia ich obserwowane zachowanie w warunkach fizjologicznych.

Badania stabilności wykazały, że przez 14 dni średnia wielkość CLA-BSA NPs wykazywała fluktuujący wzorzec w stałym zakresie, stały i wąski PDI we wszystkich temperaturach przechowywania (4°C, 25°C i 37°C), a najmniejsze wahania wielkości zaobserwowano w temperaturze 37°C, co sugeruje wyższą stabilność. Średnia wielkość zmieniała się nieznacznie w zakresie od 121 do 143 nm; ta minimalna zmienność mogła być przypisana zmianie zawartości wody wewnątrz lub na powierzchni nanocząstek, co powodowało niewielkie pęcznienie lub kurczenie się i późniejszą zmianę średnicy hydrodynamicznej przez długi czas, co okazało się istotne w wyższych temperaturach.

Podsumowując, badanie to potwierdza potencjał CLA-BSA NPs jako skutecznego systemu dostarczania klarytromycyny, oferującego poprawę właściwości farmakokinetycznych, zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną i przeciwnowotworową oraz bezpieczeństwo stosowania. Nanocząsteczki te mogą stanowić obiecującą strategię w leczeniu infekcji bakteryjnych oraz jako potencjalna terapia wspomagająca w leczeniu niektórych typów nowotworów, szczególnie raka płuc. Dalsze badania są konieczne, aby w pełni zrozumieć mechanizmy działania i optymalizować te systemy dostarczania leków dla maksymalnej skuteczności klinicznej.

Podsumowanie

Nanocząsteczki albuminy bydlęcej obciążone klarytromycyną (CLA-BSA NPs) stanowią innowacyjny system dostarczania antybiotyków, który wykazuje zwiększoną skuteczność terapeutyczną. Badania potwierdziły ich jednolity rozmiar (130-140 nm) oraz wysoką wydajność enkapsulacji (65,9%). System charakteryzuje się kontrolowanym uwalnianiem leku w warunkach redukcyjnych, co jest szczególnie istotne w kontekście terapii celowanej. CLA-BSA NPs wykazują skuteczność przeciwbakteryjną, szczególnie wobec Bacillus cereus i Staphylococcus aureus, oraz obiecujące działanie przeciwnowotworowe w przypadku komórek raka płuc A549. Nanocząsteczki cechują się stabilnością w różnych temperaturach przechowywania oraz brakiem gwałtownego początkowego uwalniania leku, co świadczy o jednolitym enkapsulowaniu. Wykorzystanie albuminy jako nośnika zwiększa specyficzność tkankową i przedłuża uwalnianie leku, poprawiając tym samym skuteczność terapeutyczną.